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Der Gesang der Nachtigall ist reich, wohltönend und laut und wird von Menschen als sehr angenehm und schön empfunden. Der Gesang ist überaus komplex und besteht aus Strophen dicht gereihter Einzel- oder Doppeltöne. Im zeitigen Frühjahr singen unverpaarte Nachtigallenmännchen ab elf Uhr nachts bis in den Morgen; der Nachtgesang dient wohl vor allem zur Anlockung einer Brutpartnerin und wird nach erfolgter Paarbildung eingestellt. Ab Mitte Mai singen daher meist nur noch unverpaarte Männchen nachts. Während der ganzen Brutsaison bis Mitte Juni singen Nachtigallenmännchen aber auch tagsüber. Der Gesang während der Morgendämmerung dient wohl vor allem zur Verteidigung des Revieres gegen andere Männchen. Nachtigallenmännchen erlernen ihren Gesang während der frühen Jugend von benachbarten Vögeln und beherrschen zwischen 120 und 260 unterschiedliche Strophentypen, die meistens zwei bis vier Sekunden lang sind. Das extrem hohe Repertoire ist damit unter den europäischen Singvögeln fast einzigartig. Der Nachtigallengesang ist vor allem aufgrund seiner Komplexität Gegenstand intensiver verhaltensbiologischer Forschung, unter anderem zur Funktion des Gedächtnisses.

Früher galt der Gesang der Nachtigall als schmerzlindernd und sollte dem Sterbenden einen sanften Tod und dem Kranken eine rasche Genesung bringen. Auch der Name der Nachtigall leitet sich von ihrem Gesang ab − ahd. gal bedeutet „Gesang“, die Nachtigall ist also der „Nachtsänger.“